T - buněčná kultura protokoly

T - buňky, které patří do rodiny imunitních buněk zvaných lymfocyty , jsou generovány v průběhu adaptivní imunitní odpovědi . T - buňky pocházejí z kmenových buněk kostní dřeně a dozrávají v brzlíku . Existuje několik různých typů T - buněk , z nichž každá má jinou funkci . T - buňky jsou od sebe navzájem rozlišeny podle přiloženého receptorem T - buněk antigenu . Podmnožina T -buněk CD4 nese značku , a pomáhá vyvolat imunitní odpověď . Zdroje T - buněk

T - buňky mohou být získány z různých zdrojů , včetně sleziny , lymfatických uzlin , a brzlíku , ale v periferní krvi je velmi snadno dostupný zdroj T - buněk pro účely kultivace . Krevní vzorky jsou pečlivě vyšetřeni na infekce a jiné nečistoty a pečlivě zpracovány v rámci bezpečnostní skříně . T - buňky jsou kultivovány z několika důvodů , včetně měření toxicity a ke studiu imunologické reakce vakcíny .
Izolace

T - buňky jsou obvykle odděleny od vzorků plné krve podle hustoty gradientu separace , jako T - buňky jsou méně husté než červených krvinek , jako jsou erytrocyty , a proto se extrahuje centrifugací . Vhodné neutrální roztok soli se přidá ke vzorku krve , následovaný Ficoll isopaque řešení . Ficoll isopaque má hustotu větší než T - buněk, ale méně než erytrocytech a v průběhu odstřeďování tvoří střední vrstvu mezi oběma buňkami , což umožňuje T -buňky , které mají být odstraněny z vrcholu . T- buňky jsou dále odstředí ,supernatant se odstraní , amalý alikvot se počítá pro stanovení životaschopnosti buněk . Buňky se používají buď přímo pro pokusy nebo kryoprezervována pro budoucí použití . Činidla
Kryokonzervace

kryokonzervace jsou připraveny v předstihu , aby se zabránilo degradaci T - buněk v místnosti teplota . Pokud to není možné , buňky jsou uchovávány na ledu nebo v chladničce . Reagencie se skládají z média pro buněčnou kultivaci a 10-13 procent lidský sérový albumin ( HSA ), proteinu , stejně jako média pro buněčnou kultivaci a 10 procent dimethylsulfoxid ( DMSO ) . DMSO minimalizuje dehydratace, změny pH , a změny koncentrace elektrolytů spojené s bodem mrazu . T - buňky jsou resuspendovány v reagencií s obsahem média pro buněčnou kultivaci a HSA v kryozkumavka . DMSO činidlo s obsahem se pomalu přidá k buňkám a jemně krouží . Buňky se potom přenesou do mrazicí nádoby obsahující isopropanolu zajistit snížení postupné teploty a uloženy .
Rozmrazování

T - buňky se rozmrazí ,kryozkumavka se odstraní ze skladování a inkubuje se při 37 stupních Celsia. Následně ,odpovídající rozmrazování medium se pomalu přidá k buňkám , dokud není dosaženo dvakrátobjem , přenese se do oddělené zkumavky a centrifugovány . Benzonase se někdy přidává do rozmrazovací médium , aby se zabránilo shlukování mrtvých T -buněk . Odstředí peleta odpověděl v kultivačním médiu buněk aživotaschopnost buněk je hodnocena . T- buňky jsou pak připraveny k použití pro jednotlivé experimenty .