Cell - Based ELISA Protocol

ELISA , nebo enzyme-linked immunosorbent assay , se používá jako diagnostický nástroj v medicíně a v biologickém výzkumu, pro kvantifikaci množství specifického proteinu . ELISA používá protilátky pro detekci proteinu zájmu a činidlo, které vytváří požadovanou barvu. Množství barvy se vztahuje k množství proteinu . Buněčná kultura

Buňky by měly být umístěny do jamek 96 - jamkové destičky s 100 mikro - litrů růstovém médiu a buňky nechá usadit přes noc . Pokud jste studoval reakci buněk " k faktoru , by buňky být sérum - hladověl po dobu 24 hodin a poté stimulovány faktorem v rámci studie .
Fixace a primární protilátka

Po odstranění média se buňky ošetřeny fixační , jako je 3 procenta formaldehydu , nebo methanolu . Buněčná membrána musí být permeabilizovány , abyprotilátka proniknout do buňky . Permeabilizaci může být dosaženo použitím 0,1 procenta Triton , v případě, že dříve byl použit methanol . Nespecifická vazba může být zabráněno pomocí 10 procent fetálního telecího séra ředěného ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku . Po odstranění bloku ,primární protilátka může být použita, a inkubovány po dobu jedné hodiny .
Sekundární protilátka a Stain

Odstraňte primární protilátky , a mytí třikrát . Přidání sekundární protilátky spojené s detekčním činidlem , jako je například křenová peroxidáza . Inkubujte po dobu jedné hodiny . Washington Přidat chemiluminiscenční roztoku substrátu . Rozvíjet a skenování deska pro barevné intenzity .