Molecular Cloning Protocols

Molecular Cloning protokoly zahrnují postupy používané pro definování, izolaci a replikaci DNA sekvenci . Tradiční omezení a vejcovodů klonování protokoly zahájit fragmentaci DNA s omezenými endonukleáz ( enzymy , které prochází řetězce DNA v restrikčních místech ) , DNA fragmentu podvaz (opravy diskontinuit ve molekul DNA ) , transfekce ( zavedení nukleové kyseliny do buňky těla) a výběr (Možnost výběru jednotlivých genomů pro replikaci ) . Izolace

protokoly pro izolaci DNA fragmentu , je prvním krokem v molekulární klonování , často obsahovat polymerázové řetězové reakce ( PMR ) , který používá cykly vytápění a chlazení pro amplifikaci části DNA . Chcete-li dosáhnout velikosti cílem sekvence , jiné protokoly zahrnují DNA ultrazvuku , reakce enzymu trávení a používání chemicky syntetizovaných oligonukleotidů . Tyto protokoly se liší v závislosti na velikosti a množství izolované DNA potřebné .
Ligační

Protokoly pro ligaci zahrnovat použití enzymu , DNA ligázy , spojit DNA molekuly spolu s kovalentní vazba . Protokol určuje kombinací fragmentů DNA , klonování vektoru , ligační pufru , DNA ligázy a sterilizovanou vodu na mikrozkumavky a inkubaci přes noc při 4 ° Celsia.
Transfection

protokoly pro transfekci nebo infuzí DNA do buňky pomocínon - virové prostředky , často zahrnují vstřikování DNA přímo do buněčné cytoplasmy . Jiné metody zahrnují použití chemických činidel , jako je například fosforečnan vápenatý a lipidů , dodat transfekci komplexu přes buněčnou membránu . Tato metoda testuje účinky genové modifikace na fungování specifických genů .
Výběr

výběr , nebo screening , protokoly určit, které buňky úspěšně proběhla DNA vložku a uvést které buňky potřebují izolaci . Odstředivka sklizně buňky, které obsahují DNA , které byly přeneseny , které jsou pak inkubovány v lysozymu (přirozeně se vyskytující enzym) pufru a nechá reagovat s alkalickým čisticím prostředkem , přičemž proteiny a membrány rozpustnost . Použití acetátu k vysrážení proteinů ,odstředivky a tenká filtrovat supernatant obsahující DNA (rozpustné kapalné zbývající z odstředěného sloučeniny ) . Supernatant se vysráží polyethylenglykolem , odstředí , a suspenduje se v chloridu česného a ethidium bromid pufru. Ethidium bromid skvrny DNA podle hustoty , a za použití dlouhovlnné UV světlo ,nižší -band DNA se extrahuje pěti cc stříkačky . V rovnovážném stavu iontoměničové kolony oddělí DNA od ethidium bromidu a chloridu česného , afinální DNA peleta se suspenduje v pufru a detekovány na agarózovém gelu .