Kryokonzervace Postupy

kryokonzervace postupy jsou ty, které umožňují buňkám , které mají být uloženy na dobu neurčitou s použitím mimořádně nízkých teplot pozastavit metabolické aktivity . Existují dva hlavní typy kryokonzervačních postupů : rovnovážné ( konvenční pomalé zmrazení ) a nerovnovážné nebo ultra- rychlé zmrazení ( vitrifikace ) . Termín vitrification pochází z latinského " skelný " nebo skelný . Oba postupy použít kryoprotektantů s vlastnostmi nemrznoucí typu , aby se zabránilo poškození buněk během procesu zmrazování . Poté, co jsou buňky zmrazeny nebo slinuté , které mohou být uloženy do nekonečna ponořením do kapalného dusíku , s velmi nízkou teplotou kapaliny o teplotě -196 ° C ( -321 F ) . Pro obnovení metabolické aktivity v buňce po rozmrazení , musí být toxické pro ochranu zmrazením odstraní z buněk a normální vodní bilance postupně obnovena jakobuňky se vrátí na normální teplotu funkční . Přehled

Přehled

kryokonzervace postupy jsou ty, které umožňují buňkám , které mají být uloženy na dobu neurčitou s použitím mimořádně nízkých teplot pozastavit metabolické aktivity . Existují dva hlavní typy kryokonzervačních postupů : rovnovážné ( konvenční pomalé zmrazení ) a nerovnovážné nebo ultra- rychlé zmrazení ( vitrifikace ) . Termín vitrification pochází z latinského " skelný " nebo skelný . Oba postupy použít kryoprotektantů s vlastnostmi nemrznoucí typu , aby se zabránilo poškození buněk během procesu zmrazování . Poté, co jsou buňky zmrazeny nebo slinuté , které mohou být uloženy do nekonečna ponořením do kapalného dusíku , s velmi nízkou teplotou kapaliny o teplotě -196 ° C ( -321 F ) . Chcete-li obnovit metabolickou aktivitu v buňce po rozmrazení , musí být toxické zmrazením odstraněn z buňky a normální vodní bilance postupně obnovena jakobuňka se vrátí k normálnímu fungování teplotu .
Cell- Specifické faktory

postup používaný k Cryopreserve buněk nebo tkáně , závisí na řadě faktorů , včetně velikosti buňky ,množství buněčné tekutiny ( cytoplasma ) asložitost buňky ( jedna buňka nebo tkáň) . Buňky s velkým množstvím cytoplasmy jako vejce jsou složitější Cryopreserve než buňky , které mají pouze zbytkovou cytoplazmě , jako spermií . Kryokonzervace ovariální tkáně je náročné, protože jsou přítomny v ovariální tkáni , z nichž každý má různé optimální potřeby zmrazení alespoň tři různé typy buněk, různých velikostí . Pomalu zamrzání protokoly byly s úspěchem použity s různými typy buněk . Vitrifikace je v současné době nejúčinnější s jedno - buněk zmrazením a méně efektivní s tkání , ale výzkum je pokračující optimalizace vitrification tkání .
Role kryoprotektantů

cytoplasmy buňka obsahuje vodu , která se mění na krystalky ledu při teplotě mrazu . Když se vytvoří led uvnitř buňky , buňka se kousky a umírá . Z tohoto důvodu ,tekutina v buňce musí být odstraněny před dosažením teploty pod bodem mrazu , aby nedošlo k poškození buněk . Různé typy nemrznoucích ( cryoprotectant ) kapalin mohou být použity k dehydrataci buňky před zmrazením , včetně glycerolu , propandiol , dimethyl sulfoxde ( DMSO ) , ethanol a cukry , jako je sacharóza a trehalóza . Optimální rychlost chlazení ( a rozmrazování ), závisí na typu použitého cryoprotectant a na charakteristice buňky nebo tkáně, která má být ( nebo to bylo ), zmrazená . Zmrazením jsou toxické pro metabolizaci buňky tak buňky s expozicemi vůči kryoprotektantů v teplejších metabolických teplotách musí být minimalizovány nebo zabránit . Při rozmrazování nebo ohřívání buněk , zmrazením musí být zcela odstraněn z buňky před obnovena metabolická aktivita .
Equilibrium Versus Non - Equilibrium kryokonzervace řádu

míra zmrazení závisí na tom, zda je protokol zmrazení je rovnováha nebo non- equilbrium bázi . U postupů typu rovnováha ,optimální rychlost zmrazování je dosaženo v případě, že jerovnováha mezi rychlostí , při kterébuňky je dehydrovaný vody a rychlosti , při které voda vně buňky se převede na fázi ledu . Tato rovnováha nebo pomalu - freeze protokoly obvykle trvat několik hodin na dokončení apočítač se používá ke spuštění programovatelný rychlost mrazničku , aby zajistily , že sazby zamrzání přesně podle potřeby . Tam je typicky" hold " krok do protokolu u startu , aby ruční vytváření startovacích ledových krystalů nebo " setí " v tekutině vně buněk . celým

zeskelnění , se používázcela odlišný přístup k zmrazení , že se nespoléhá na rampách a dosažení rovnováhy mezi dehydrataci a tvorbě ledových krystalů . Vitrifikace je tak velmi rychlá , že není dostatek času pro tvorbu ledu abuněčná tekutina se převede přímo do sklivce nebo skleněné fáze , bez poškození buňky . Programovatelné mrazničky sazeb není nutné , protožebuňka je přímo ponořila do velmi chladného kapalného dusíku , dosažení okamžité skelný stav .
Slow - Freeze Postup

První krok postup pomalé freeze je vystavit buňky cryoprotectant v postupném postupným způsobem , aby se pomalu , aby ekvilibrace buňky s cryoprotectant při uvolnění vody . Poté, co buňky byly vymazány většiny buněčné vody , což jsou buňky v ochranném kapaliny se umístí do nádoby s nějakého druhu, jako je například sláma plastové , skleněné ampule nebo plastové objemu vial.The kapaliny obklopující buňky pro pomalé tuhnutí je obvykle nižší než lžičkou a může být jen pár kapek . Pre - značený nádoba je naplněna , utěsněna a dát do programovatelného mrazáku , který pomalu snižuje teplotu v kontejneru po dobu minut nebo hodin na velmi nízké teploty . Po několika minutách chlazení , startovací ledové krystalky , musí být vytvořen uvnitř kontejneru " setí " kontejneru . Setí se provádí pomocí nástroje ( např. kleště ), které byly předem vychlazené v kapalném dusíku na dotek nádobu a způsobit tvorbu ledových krystalů . Tato startovací krystal zahájí řízené tvorbě ledových krystalů na jednom místě , v bezpečné vzdálenosti od buněk . Po setí je kompletní , můžezbytek chlazení rampy pokračovat . Když je nádoba dosáhne teploty mezi -30 a -85 ° C ,kontejner obsahující mohou být buňky , která přímo do tekutého dusíku pro dokončeníochlazení na -196 ° C.

vitrifikace

Ultra - rychlé non - rovnováha chlazení postupy, jako je zeskelnění použít vyšší koncentrace kryoprotektantů spolu s téměř okamžitá rychlost tuhnutí dosaženo ponořením buněk přímo do tekutého dusíku . Vitrifikace obchází formace fáze ledu krystal a pohybuje vodu přímo do fáze sklovitý . Vitrifikace dosahuje stejného koncového bodu jako pomalé zmrazení , ale v dávce -3000C/min , ve srovnání s 10C/min nebo více . Zeskelnění , buňky jsou obvykle umístěny na špičce slámy a nadbytek cryoprotectant se odstraní , takže jen natolik, žebuňka lpí na nádobě povrchovým napětím , před vrhat v kapalném dusíku . Vzhledem k tomu, zmrazení je tak rychlý ,doba expozice kryoprotektantů je mnohem méně , a mnohem vyšší koncentrace kryoprotektantů mohou být tolerovány buňkou . Oteplování buňky k návratu do normálního metabolického fungování musí být také neuvěřitelně rychlý . Manipulace s glazované vzorků je mnohem náročnější , než pomalu zmrazených vzorků , protože ikrátká expozice na teplotu vyšší, než kapalného dusíku může zahájit proces neplánované oteplování a zmrazení , které je škodlivé pro buňky .