Proč jste potřebovali promývat studny po každém kroku?

Promytí jamek mikrodestičky po každém kroku v různých biochemických a molekulárně biologických testech, jako je ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), izolace DNA/RNA, PCR a Western blotting, je nezbytnou součástí experimentálního protokolu. Účelem promývacích kroků je odstranit zbytková činidla, reakční složky nebo jakékoli kontaminanty, které by mohly interferovat s následnými kroky nebo ovlivnit přesnost a specifičnost testu.

Zde je několik důvodů, proč jsou kroky mytí nezbytné:

Odstranění nenavázaných látek: Kroky promývání po přidání činidel nebo protilátek pomáhají odstranit veškeré nenavázané látky, jako jsou nadbytečné protilátky, nespecifické vazebné molekuly nebo reakční složky, které nejsou zachyceny nebo navázány na pevnou fázi. To zajišťuje, že detekční signál je specifický a bez rušení pozadí.

Minimalizace křížové kontaminace: Kroky promývání účinně snižují riziko křížové kontaminace mezi vzorky. To je zvláště důležité, když se zpracovává více vzorků současně, protože to zabraňuje přenosu reakčních složek nebo kontaminantů z jedné jamky do druhé. Promývání pomáhá zachovat integritu a přesnost výsledků jednotlivých vzorků.

Účinné odstranění rušivých látek: Promývání je nezbytné k odstranění látek, které by mohly rušit následující kroky. Například v testu ELISA pomáhá promývání eliminovat nenavázané komplexy konjugát-protilátka, čímž se snižuje vývoj barvy pozadí a zvyšuje se specifita kolorimetrické reakce. Při PCR se promytím odstraní nukleotidy, primery a polymerázy z předchozích amplifikačních cyklů, čímž se minimalizuje riziko přenosu kontaminace a zajistí se přesná amplifikace v dalším cyklu.

Standardizace a reprodukovatelnost: Dodržováním standardizovaných mycích postupů vědci zajišťují, že podmínky jsou konzistentní napříč experimenty a mezi různými laboratořemi. Tato konzistence je rozhodující pro získání spolehlivých a reprodukovatelných výsledků.

Promývací postup může zahrnovat použití vícekanálové pipety nebo automatické promývačky destiček k dávkování a odsávání promývacího pufru. Promývací pufr je typicky pufrovaný fyziologický roztok, který se podobá složení původního pufru použitého v testu, ale neobsahuje žádné reakční složky.

Rozhodující je dostatečné mytí bez nadměrného mytí. Přílišné promývání může vést ke ztrátě základních složek vázaných na pevnou fázi a ovlivnit citlivost testu. Proto jsou promývací protokoly pečlivě navrženy tak, aby bylo dosaženo optimálního odstranění nežádoucích látek při zachování integrity imobilizovaných molekul nebo sledovaných analytů.