Jak odstraňovat tři Fragment ligace

ligace jemetoda používaná v biologickém výzkumu pro spojování oddělených řetězců DNA . Tento proces byl zjednodušen použitím komerčně dostupných ligačních výstroje. Vejcovodů postup se obvykle následuje transformace , proces vkládání stal DNA do bakteriálního vektoru příjemce , klonovat a zesílit DNA . Vzhledem ke složitosti metody , výsledky často neodpovídají požadovaným produktem a vyžadují řešení problémů . To je převládající ve snaze spojit několik fragmentů , jako je například v trojité ligaci . Věci, které budete potřebovat klipart Ligation sadu
ligace protokol
agarózovém gelu
50 X TBA vyrovnávací paměti ( 242 g Tris báze , 57,1 ml ledové kyseliny octové , 100 ml 0,5 M EDTA ředí na 1 litr vody )
deionizovaná voda
DNA purifikační kit
Zobrazit další instrukce
Poradce transformace
1

Formulovat seznam kroků zapojených do ligace a transformace . Řešení problémů vědecký protokol obvykle začíná s posledním kroku , pracovat dozadu .
2

Porovnání čištěné DNA produkt ze vzorku kontrolní DNA , opatřené soupravou . Poté, co DNA byla transformována a klonován v bakteriích , může být izolován , čištěn a kontrolovány elektroforézou na agarózovém gelu . Výsledky pro elektroforézu by uvést, zda transformace byla úspěšná .
3

Určete růstu bakterií během klonování . Většina bakteriální vektory jsou konstruovány tak, pouze ty, které se DNA insertu - se růst na médiu obsahujícím ampicilin , nebo jiné antibiotikum . Špatná růst by mohl prokázat, ževzorek DNA byl úspěšně vložen do vektoru .
4

Ujistěte se, ževzorek DNA liguje se čistí , před transformací . Pufry a ligace enzymy mohou inhibovat transformaci vložené DNA . Je také důležité , aby se ujistil, želigace byl enzym inaktivován teplem , po dokončení procesu ligace . Aktivní ligase by mohly interferovat s transformací .
5

Zkontrolujte datum na bakteriální vozidel používaných pro transformaci . Staré bakteriální buňky ztrácejí účinnost v průběhu času . Nakonec jsou bakteriální buňky jsou schopny transformace a kvalitní klonování . Poté, coproces transformace byl diagnostikován , můžete začít analyzovat proces ligace .
Řešení problémů ligace
6

Potvrďte čistotu Vašeho vzorku DNA , před ligaci . Sůl nečistoty ve vzorku DNA může mít za následek špatnou ligaci . Vzorek DNA by měla být čištěný a bez solí a enzymů , před tím, než se používá v ligaci .
7

potvrdit, zda konce řetězců DNA , které mají být ligované tupé nebo lepkavé . Ligace se používá k propojení oddělených pramenů s tupými konci nebo lepivých konců , po digesci s určenými restrikčními enzymy . T4 DNA ligáza jeenzym volby tupých konců DNA, - ale také pracovat pro DNA s lepivými konci . Ostatní DNA ligáz mohou pracovat pouze DNA , poomezení strávit na vytvoření lepivé konce . Je důležité používat správné ligázy pro DNA testované .
8

Kontrola koncentrace DNA vzorků před podvázání . Použití DNA s vysokou koncentrací často způsobí, že DNA , aby se lineární. Pokyny pro kit bude poskytovat informace o správném množství DNA pro použití v ligační reakci .
9

Vyměňte ligázou enzym s novou hodně . Enzymy jsou zvláště citlivé na teplotu místnosti a pokračující zmrazovacích cyklech . Ligase by mohl být poškozen po několika použití , jednoduše tím, že zmrazení a rozmrazení příliš mnohokrát . Některé sady doporučujeme, aby ligase se připravte do menších porcí během počátečního použití , ke snížení počtu případů, kdy to je znovu zmrazit .
10

Zkontrolujte ligační soupravy . Často je problém s podvaz používá kit, který již vypršela nebo byla nakažena jinou DNA a solí .