Jak provést ELISA

ELISA nebo enzymatického imunoabsorbent testu , jebiochemická laboratorní technika provádí pro detekci antigenu (například protein ) nebo protilátky v experimentálním vzorku . Test využívá protilátky vázající antigen a mohou být použity pro testování další buněčné a molekulární mechanismy závazné i . V testu ELISA na bázi proteinu ," zachytit " protilátky nebo protein je stanoveno v testu misky a nechá se držet misky , po kterém" sonda " prostředek (např. něčí proteinu zájmu ) je stanovena a inkubuje se záchytným činidlem . Po několika myje ," Detekce " protilátky se přidá , aby bylo možné vizualizovat v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátky , antigen nebo protein - protein vázající . Věci, které budete potřebovat
testu misky ( např. 96 - dobře bloku )
zachytit protilátky ( ředí na 5 ug /ml v 50 mM NaHCO2 , pH 9,6 )
sondy protilátky /protein ( zředěn na různé koncentrace ) Spojené detekci protilátek ( např. křenová peroxidáza - vázané protilátky ) celým PT pufru ( 1x PBS , 0,05 procenta Tween - 20 ) celým blokovacím pufru ( 1x PBS s 5 mg /ml BSA , nebo 5 procent odtučněného mléka v 1x PBS )
činidla Detection ( tj. TMB činidlo směs)
Mechanické laboratorní třepačce
studené místnosti nebo lednice
pipetou a tipy
Zobrazit další instrukce

1

zředí zachycené protilátky, 5 ug /ml v 50 mM NaHCO2 ( pH 9,6 ) . Přidá se 50 ul do každé jamky vzorku misky sloužící k testování . Zakryjte plastu nebo hliníku a inkubovat přes noc při 4 ° C na třepačce .
2

výpis z zachycené protilátky a umýt dvakrát s 200 uL PT vyrovnávací paměti . Přidat 200 ul blokovacího pufru do každé jamky ( PB nebo 5 procent odstředěné mléko ) . Inkubujte kdekoli od dvou hodin až přes noc při třepání při teplotě 4 ° C.
3

výpis z blokujícím pufru a umýt 4krát 200 uL PT vyrovnávací paměti . Přidat " sondy " Vzorky proteinů v různých koncentracích v PB nebo 5 procent odstředěného mléka , přidání 100 ul na jamku . Inkubujte jedna hodina třepání při 4 ° C, výpis z řešení sondy a umýt šestkrát s 200 uL PT vyrovnávací paměti .
4

Přidat detekční protilátky ( HRP - konjugát ) se zředí 1:4000 v PB pufru nebo 5 procent odstředěné mléko ( buď jedna obsahuje 0,05 procenta Tween - 20 ) , přidáním 50 ul na vzorek dobře . Inkubujte po dobu 30 minut až jednu hodinu za třepání při 4 ° C po
celým 5

Dump out řešení detekce protilátek a promyje 6 krát 200 ul PT pufru na jamku , po němž následuje promytí dvakrát 200 ul 1x PBS ( fosfátem pufrovaný fyziologický roztok ) . Výpis z PBS a přidá se 100 ul detekčního činidla na jamku ( pro HRP , použití čerstvě smíšené TMB činidlo smícháním TMB substrátu a peroxidu v 01:01 ) . Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě za občasného protřepání . Celým

při použití TMB a HRP : na závěr se přidá 100 ul 1 M H3PO4 ( kyselina fosforečná ) na jamku , aby se rozložil na TBM reakce

čtení desku pomocí čtečky analýzy vzorku , jako je například 96-jamkové čtečky talíři . . ( Pro HRP a TMB , použijtešablonu " ELISA End - Point Test " k dispozici na většině čtenářů . )