Cell Surface Biotinylace Protocol

Biotinylace využívá schopnost rozpustný vitamín biotin vázat se na buněčné proteiny . Biotin se váže na protein strepavidin a je proto vhodné v buněčné biologii pro vizualizaci buněčné proteiny . Biotinylace umožňuje bezpečné označování proteinů ve srovnání s technikami, jako je radioaktivity a nemá vliv na normální funkci buňky . To umožňuje výzkumníkům studovat buněčné proteiny , jako jsou receptory , a který umožňuje větší porozumění nemocí a chorobných procesů . Etiketovací Závěsné Buňky

Mycí buněk v ledově chladného fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku ( PBS ) pro odstranění znečišťujících látek . Nárazníky obsahující tris a glycin bude soutěžit s biotinylace a je třeba se vyhnout . Aby se zabránilo biotinylating vnitřní proteiny ,značení může být prováděna při 4 ° C , nebo v přítomnosti azidu . Ponořte buňky v PBS a rozpustné biotin , sulfo - NHS - LC - biotin .
Značení Adherentní Buňky

umyjte buňky v PBS a inkubovat s výrobkem , jako je sulfo - NHS - LC - biotin . Buňky jsou pak poškrábaný do misky a lyžují v pufru obsahujícím detergent Triton - X 100 a připravené pro vizualizaci .
Příprava značených buněk

Po inkubace se buňky odstředí na pelety a promyty v PBS . Buňky se resuspendují v PBS a čistí se IgG Sepharose gelu . Vázaný protein se zředí v pufru a směs se zahřívá na 100 stupňů Celsia .
Vizualizace buňky

Naředěné proteiny mohou být vizualizovány pomocí sodium dodecyl sulfát elektroforézou na polyakrylamidovém gelu ( SDS - PAGE ) a poté blotting s proteinem a směs enzymů , peroxid streptavidin - křenová . Skvrny jsou zobrazeny s chemickou reakcí --- --- chemiluminiscence , který vyzařuje světlo . Specifičnost biotinylace lze potvrdit s protilátkami na bílkoviny v rámci studie .