Jak si vyrobit protilátka Ředění pro IHC

imunohistochemie ( IHC ) jespecialista techniky používané vědci k vizualizaci buňky uvnitř tkání, které byly umístěny na sklíčko a obarví vhodnou protilátkou, která rozpoznává protein, který je charakteristický pro buňky nebo tkáně pod vyšetřování . Protilátek ředění ( titrace ) , musí být prováděno pomocí experimentální podmínky stanovené ve vlastním protokolu uživatele , ne že výrobce na protilátky , protožedva nemusí být identické . Věci, které budete potřebovat
buňky na skvrny
protilátky
ředicím pufrem ( " ředící " ), klipart Pipety a tipy
mikrozkumavky
Hliníkové fólie
značky Lab a štítky trubky
ledu
světlo chráněné slide box
Zobrazit další instrukce dovolená 1

Zkontrolujte a připravit protilátku . Zkontrolujte, zda je protilátka byla zvýšena ve správném hostiteli , a reaguje s přesným verzi proteinu ( známé jako isoformy nebo spojovací variantu) , který je testován. Pomocí pipety , pečlivě se 10 mikrolitrů část tohoto a označení jako " osobní doručení " .

Pokud jsou k dispozici pouze velmi malé objemy protilátky , tento krok přeskočte .

Vedení osobní zásob protilátky je rutinní praxí ve všech laboratořích , které zabraňuje křížové kontaminaci původní populace . Naneste to do lehkého chráněné mikrozkumavky , nebo normální mikrozkumavky , která je zabalená v hliníkové fólie pro ochranu před přímým světlem . Celým

Udržujte trubice na ledu , s výhodou v esky s víkem vzduchotěsné , znovu , aby se minimalizovalo světlo , které mohou zničit protilátky . Poznamenejte koncentrace původního genofondu (např. 100 jednotek na mililitr , 1 miligram na microliter a tak dále ), na trubku , včetně názvu protilátky a co , pokud vůbec, ztlumil se ředí v ( např. sérum, fyziologický roztok , nebo vody atd.) .
2

Připravte ředicí pufr, také známý jako ředidlo protilátek . Zkontrolujte, zda je to v souladu s protilátkou a imunohistochemicky postup používán , například , to by nemělo zakrývat žádnou fluorescenci nebo bránit následné označování sekundární protilátky . Proveďte standardní ředění imunohistochemie ( iblokovací pufr) smícháním 1X fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem s 1 % Triton - X100 , 10 % fetálního telecího séra a 0,2 % azidu sodného .
3

titruje protilátka . S danou koncentraci protilátky v osobním skladem ( vyjádřené jako koncentrace jednotek , jako jsou mikrogramů na mikrolitr ) , stanovit objem protilátky potřebné k získání 10 mikrogramů protilátky .

Nastavit sérii zředění pipetování objemu což odpovídá 2 mikrogramů protilátek ( např. X mikrolitrů ) , v 100 ul ředidla a důkladně se promíchá pipetováním nahoru a dolů . Z tohoto výchozího ředění přijmou stejná X ul a dodává, že do následného 100 ul ředidla . Tento postup opakujte , dokud 8-10 ředění ( nebo série ) se skládá .

Poslední trubka bude tedy mít nejnižší koncentraci a být" tvrzené " koncentrace, která bude generovat nejvyšší úroveň signálu v průběhu experimentu . Nicméně ideální koncentrace bude o něco větší , než je tato koncentrovaná , takže ne moc signál je produkován , což může vést k chybám na pozadí . Celým

Označte trubky správně s novými zředěných koncentracích.