Co je gelová elektroforéza
? Gelová elektroforéza jezpůsob separace , identifikaci a charakterizaci směsi proteinů nebo nukleových kyselin . Denaturované vzorky migrovat po aplikaci elektřiny v tenké , vlhké gelu obvykle vyrobené z polyakrylamidu nebo agarózy . Oddělené vzorky jsou zbarveny tak oni mohou být viděni . Gelová elektroforéza se používá na bílkoviny a výzkumu nukleových kyselin a v nemocnicích pro identifikaci neobvyklých proteinů nebo DNA vzory pro diagnostiku onemocnění , genetické vady a genetické vztahy . Příprava vzorku
detergent , jako je dodecylsulfonate sodný ( SDS ) se přidá k proteinu nebo nukleové kyseliny , sedetergent spojovat se a rozvinout ( denaturované ) proteiny a nukleové kyseliny . Denaturace proteinů usnadňuje stanovení jejich molekulové hmotnosti v elektroforéze . Množství vzorku zapotřebí, je obvykle 100 až 500 ng na vzorek pásu pro proteiny a 5 až 100 ng na pásmo pro nukleové kyseliny v celkovém objemu asi 25 až 40 ul .
Gely
celým
gel , obvykle vyrobený z polyakrylamidu nebo agaróza , se mohou připravit nebo zakoupeného oddělit tyto proteiny . Gel jehodně jako želatina . To je většinou voda , ale je dostatečně pevná pro manipulaci . Gely obsahují pufr pro řízení pH . Gel je velmi tenká (od 1 do 2 mm) a obdélníkové . Na jedné straně vypadá jako hřeben s mnoha chybějících zubů . Mezery jsou nazývány studny .
Sample Loading
Jeden místagel v komoře s pufrem a denaturované bílkoviny jsou přidány do jamek . Vzorky se známou molekulovou hmotností jsou přidány do vnější jamek . Gely se vyrábějí s různým množstvím polyakrylamidu . Nízká pevnost gelu ( 4 procenta) je lepší pro separaci molekuly s vysokou molekulovou hmotností , zatímco vyšší pevnost gelu ( 12 procent ) se používá pro vyšší molekulové hmotnosti molekuly . Gradient gel se liší v síle gelu a lze oddělit celou řadu proteinů se ztrátou některých řešení .
Elektromigrační
Při použití vysokého elektrického napětí , denaturované proteiny pohybovat směrem ke spodní části vrtu . Čím vyšší je hmotnost proteinu , tím pomaleji se pohybuje . Pokud jeelektřina vypnuta , bílkoviny zastaví . Jeden odstraní gel z komory a skály jej v misce s barvivem . Organická barviva , jako Coomassie modří nebo kovových barviv se používá k skvrn proteiny , zatímco fluorescenční barviva jako např. ethidium bromid se používají pro nukleových kyselin .
Analýza výsledků
S Po odstranění přebytečného skvrny , je vidět, že směsi rozdělit na skupiny, které vypadají jako žebříky . Poloha pásem je v porovnání s přepravní vzdálenosti normami pro stanovení molekulové hmotnosti vzorku v každém pásmu . Gel může být dehydrovaný s alkoholem a vysuší tak, aby mohl být spasen . Intenzita barvy kapely pak může být měřena pro stanovení koncentrace proteinu v každém pásmu .
Protokol Vývoj
standardní protokoly jsou k dispozici pro práci s i- známé proteiny . Je-libadatel pracuje s neznámým vzorkem ,pevnost gelu , typ pufru , pH pufru , napětí , běh času , a skvrna může vše musí být optimalizovány tak, aby získali co nejlepší separaci a signál .
protokoly
