Řešení problémů pro gelová elektroforéza

elektroforézou na polyakrylamidovém gelu , nebo na straně , je technika běžně používaná pro separaci organických molekul v biologickém vzorku . Molekuly s nižší velikosti a hmotnosti migrovat rychleji na polyakrylamidovém gelu při použitíelektrického proudu . Čisté odlišné skupiny jsou obecně pozorovány podokončení gel se inkubuje v určité skvrny . Je topoměrně jednoduchá metoda . Nicméně, absence proužků nebo pásů , které jsou nebo nátěr z nečistého může znamenat problém v jednom nebo více kroků způsobu . Měli byste dodržovat základní pokyny pro řešení metodu gelové elektroforézy , když jsou vaše výsledky nejsou , jak se očekávalo . Věci, které budete potřebovat
stupeň kvality bis : akrylamidu nebo prefabrikovaných desek
dvou skleněných desek
akrylamidu : Bis
TBE pufru ( Tris, kyselina boritá , EDTA ) klipart Napájení
Horní vyrovnávací komora
Dolní vyrovnávací komora
Protein ze vzorku DNA
TEMED
persíran amonný
gel skvrna
Zobrazit další instrukce dovolená 1

Začněte s Posledním krokem gelové elektroforézy první a pracovat dozadu . Pro gelové elektroforézy ,Posledním krokem jebarvení postup pro pozorování vzorků pásem. Několik problémů by skutečně došlo v průběhu řízení barvení . Nicméně , v prášku skvrny by měly být dobře rozpustí ve vhodném pufru před tím, než jsou použity na skvrnu gelu . Zjistěte byla použitasprávná koncentrace skvrny .
2

Zkontrolujte napájení . Absence kapel by mohlo naznačovat,proud nebo napětí nastavení byla příliš vysoká a zkušební vzorky se stěhovali pryč gel . Vysoké nastavení může také způsobit ukázkové komponenty migrují přes gelu příliš rychle , což způsobuje špatné rozlišení a kapely , které se objevují nečisté . Vzorky nesmí migrovat do gelu , pokudnastavení napájení je nízká . Vzorky mohou také driftovat ze studny , kde byly naloženy , a ne migrují přes gelu .
3

Zkontrolujte kapaliny akrylamidu slouží k obsazení polyakrylamidovém gelu . Typicky ,procento akrylamidu zvyklé na obsazení polyakrylamidovém gelu se pohybuje od 5 do 15 procent . Vzorky složené z větších molekul jsou načteny na 5 procent gelu , protože velké úlomky pohybovat pomaleji na gely s vyšší akrylamidu v procentech . Malé molekuly jsou naložena na vyšší procenta gelu , protože nízká koncentracegelu by neměl být schopen rozlišit menší vzorky .
4

Zkontrolujte činidel používaných pro polymeraci akrylamidu . Polyakrylamidovém gelu se vytvoří polymerací kapalné směsi, sestávající z bisakrylamid a akrylamidu . Persíranu amonného a TEMED jsou přidány do akrylamidu katalyzovat tvorbu gelu . Typicky ,akrylamidu měla vykazovat známky polymerace ( tvorby gelu ) 15 minut po persíranu amonného a TEMED byly přidány . Polymerace , který se vyskytuje příliš rychle, jevýsledkem velkého množství persíranu amonného . Příliš málo amonný persulfate může způsobit neúplné nebo nerovnoměrné polymeraci .
5

Potvrďte množství vzorků zatížených . Vysoké koncentrace vzorků se mohou pohybovat velmi pomalu přes gelu a snížení rozlišení kapely . Koncentrace vzorku , která je nízká , může to být pozorovány pogel se obarví. Tyto skvrny mají svá omezení , pokud jde o minimální množství vzorku , které může být obraz vytvořen v důsledku citlivosti skvrn .
6

kvalitu Potvrdit vzorků zatížených . Soli a jiné nečistoty přítomné ve vzorku, může mít vliv na pohyb vzorku podél gelu . Elektroforéza jedůsledkem elektrického proudu protéká gelem, který obsahuje elektricky vodivá pufru; vysoké koncentrace soli ve vzorku, může mít vliv na pohyb tohoto proudu přes gel . Váš izolace vzorku by měla obsahovat sadu čištění , které bude produkovat relativně čistý vzorek .
7

Přehled literatury nebopísemný protokol , zdasprávný PAGE byl použit k provedení experimentu . Procento akrylamidu v PAGE je specifická pro velikosti testovaného vzorku . Literatura by také poskytnout konkrétní informace s ohledem na zřízení napájecího zdroje a rychlosti vzorku migrace .