Western blot k obsluze

Western blot analýza jedobře známou technikou pro identifikaci specifických proteinů izolovaných z tkáně . Různé proteiny se nejprve oddělí od náboje a hmotnosti na SDS - polyakrylamidovém gelu a přeneseny na nitrocelulózovou membránu . Po převodu , značené protilátky se specificky váží na požadovaný protein a fotografoval pomocí X - ray film nebo zviditelněn protein specifické skvrny . Konečný výsledek ukazuje tmavé pruhy indikující přítomnost identifikovaného proteinu . Tento článek se zaměřuje na základní metodiky pro provádění Western blot analýzy v laboratoři kvalifikoval pro komplexní výzkum proteinů . Věci, které budete potřebovat
SDS - polyakrylamidovém gelu ( SDS - PAGE ) s oddělenými proteiny
nitrocelulózovou membránu
destilovanou vodou
Převod vyrovnávací paměti (30 g Tris , 144 g Glycin a 200 ml methanolu v 1 litru voda )
Filtrační papír Whatman 3 mm
Laboratorní houba
blot Western přepojení komora
Laboratorní zdroj
Laboratorní lednice
Laboratorní míchadla
Tris pufrovaný fyziologický roztok ( TBS ) ( 24,2 g Tris báze , 80 g NaCl v 1 l vody )
Blokování roztoku ( 5 procent nemastný sušené mléko v TBS )
řešení primární protilátka
popsané roztoku konjugátu protilátka
alkalické fosfatázy roztok substrátu s nitro blue tetrazolium skvrna
fosfátový pufr ( PBS ) klipart gel - imager box
Zobrazit další instrukce
Přenos proteinů na nitrocelulózové membráně
1

Připravte nitrocelulózy membránu . Membrána by měla být ponořen v destilované vodě po dobu dvou minut , pak umístěny do přenosového pufru a nechá máčet po dobu pěti minut .
2

Sestavte přenosu sendvič se skládá z houbičky /filtračního papíru /SDS PAGE /nitrocelulózy membrána /filtrační papír /houba . Sendvič se nastaví tak, že membrána se nachází blíže k anodě agel blíže ke katodě uvnitř přenosového komory .
3

Přidat přenosu pufru v komoře tak, aby se sendvič ponořena . Umístěte komoru uvnitř laboratorní chladničky . Přenos proteinů z gelu na membránu by mělo být prováděno při teplotě 4 ° Celsia.
4

Nastavení napájení pro přenos proteinů z gelu na membránu . Směr přenosu je k anodě označené červenou vedení . Větší proteiny pohybovat rychleji v reakci na elektrický proud a bude pohybovat jako první . Napájecí zdroj řídí rychlost přenosu . Nastavte sílu až 30 V a 40 mA pro přenos přes noc .
5

Rozeberte napájení po dokončení přenosu . Nedělají kontakt s přenosovou vyrovnávací paměti nebo odstranit sendvič , zatímconapájení je připojen .
6

Odstraňte membránu z sendvič a inkubujte po dobu dvou hodin v blokovacím roztoku . Proteiny v blokovacím roztoku se absorbuje do membrány , kde jsou přítomny žádné bílkoviny . To zabrání jakékoliv protilátky z vazby na membránu , kde je požadovaný protein není přítomen .
Vazbaprotilátky
7

Inkubujte nitrocelulózovou membránu s roztokem primární protilátky za použití míchadlo . Membrána musí být zcela ponořena v roztoku po dobu alespoň jedné hodiny. Je přijatelné , aby inkubovat přes noc .
8

umyjte membrány důkladně odstranit nevázané protilátky . Čtyři samostatné 10 - minutové promytí TBS jsou obvykle dostatečné pro odstranění přebytečné protilátky .
9

Inkubujte membránu v značeného roztoku konjugátu protilátka pomocí míchadla . Membrána musí být inkubována na nejméně jedné hodiny. Značená protilátka konjugát se váže na alkalické fosfatázy . Je toenzym -protilátka mix , který bude rozpoznávat a vázat se na první protilátku .
Detekce proteinu
10

vypláchněte membránu po dobu 10 minut v PBS čtyřikrát . Tím se odstraní zbytek značené protilátky konjugátu .
11.

Inkubujte membránu v alkalickém roztoku fosfatázy substrátu , dokud se nezobrazí kapela vzory . Barviva v roztoku substrátu se bude vázat na antigen-protilátka - protein v membráně a tvoří tmavě zbarvený pás . Tento proces může být okamžité nebo trvat až 30 minut před jsou dodrženy kapely .
12

Zabalte membránu zcela v celofánu , a umístit jej přímo na gel - imager pro vizualizaci výsledků . Gel - imager schopný fotografovat výsledky zobrazené na Western blot membrány .