Jak provést FRET Assay

přenos fluorescenční rezonanční energie ( FRET ) jetechnika Test použitý k měření přítomnosti a množství vazby mezi dvěma reportér vázaných proteinů . Tento test se běžně používá k analýze potenciálně vazebných proteinů v různých typech buněk , a pro měření účinnosti konjugace typu enzymů . Detekční zařízení potřebné , závisí do značné míry na druhu reporterových molekul používány , i když mnohokrátjednoduchý 96 - jamková destička reader mohou být použity. Věci, které budete potřebovat
Protein-of-interest/Reporter molekuly vytváří pro každý protein je testovaný
96 -jamkové desky bloku
96 - jamková destička čtenáře
reakčního pufru ( obecně Tris - nebo fosfát - vyrovnávací paměti , fyziologický roztok na bázi )
Konjugace enzym (v případě potřeby )
Zobrazit další instrukce
instalace a čtení
1

Vytvořit nebo připravit fúzní konstrukty každého proteinu zájmu , s každým je spojena s fluorescence přenosových molekuly jako zelený fluorescenční protein ( GFP ) , rhodamin nebo bor - dipyrromethene ( BODIPY ) .
2

Určete absorbance a emisní vlnové délky každé fluorescenční složky a na celkový test . ( Například , v případě, že test měří GFP -> přenos energie fluorescence rhodamin ,vstup absorbance vlnová délka je, že GFP absorbance ( 488 nm ) , a detekční vlnová délkaje, že pro rhodamin ( 595 nm ) ) celým .
3

Vytvořte odpovídající reakční pufr pro experiment , v závislosti na proteiny biochemických vlastností zájmu je . TRIS pufr na bázije často používán , včetně chloridu vápenatého a 0,05 procenta Tween - 20 . Konkrétní koncentrace a komponenty mohou být určena pro vyhledávání zápisů podrobně podobné reakce a podmínky .
4

Smíchejte dva reportérové ​​konjugované proteiny zájmu v různých koncentracích v reakčním pufru , a alikvotní 50-200 ul na jamku . Přidání konjugační enzym ( například , sortase ) ke každému vzorku a pokud je to vhodné . Při provádění koncového bodu testu je , aby inkubace při pokojové teplotě ( nebo enzymu optimální teplotu ) po stanovenou dobu , pak čtěte dál 96 -jamkové čtečce destiček . Pokud provádíte stanovení kinetiky , přejděte přímo ke čtení ( viz níže ) .
5

Vložte ukázkový talíř do 96 -jamkové čtečce destiček . Vytvořit nový experiment stránku a otevřete menu nastavení . Zadejte správný absorbance ( excitace ) a emisní vlnové délky , vyberte příslušné jamky je třeba číst .

Pokud provádíte kinetiky experiment , nastavte časový průběh experimentu a interval období četby (např. jednou za 10 minut) .

Začněte čtení vzorek .

Analýza dat pomocí funkce grafů aplikace Microsoft Excel (nebo jinou grafickým programu například GraphPad ) .