Jak rozpoznat NADH

nikotinamid adenin dinuceltoide ( NADH ) , zkráceně " NAD " , jekoenzym nalézt v živých buňkách, které produkuje chemické reakce v proteinech . Farmaceutické společnosti studovat NADH , protože jeho metabolismu procesu , a synteticky vytvořit pro řadu účelů . Vzhledem k tomu, NADH je mikroskopický , můžepouhým okem není na místě ji . Musíte vědecké testování a testovací kit pro detekci jeho přítomnost . Věci, které budete potřebovat
suchý led klipart Micro - odstředivky
zkumavek Eppendorf
Zobrazit více Instrukce
Rekonstituce reagencie
1

Nastavte cyklistické vyrovnávací paměti na počítadlo a umožňujívyrovnávací dosáhnout pokojové teploty . Ideální teplota pro vyrovnávací paměti je 22 stupňů Celsia .
2

Rozpusťte NAD cyklistický enzym směs s přesně 220 ul na cyklistické vyrovnávací paměti . Zmrazit řešení v teplotách pod -70 stupňů Celsia .
3

Rozpusťte NADH developer s 1,2 ml ddH2O . Jemně promíchejte roztok , dokud se úplně nerozpustí . Nepoužívejte vír .
4

standardní Rekonstituujte NADH s 200 ul čistého dimethylsulfoxidu .
Příprava vzorku
5

Buňky se promyjí fosfátovým pufrem .
6

pelety 2x10 ( 5 ) buňky pro každý jednotlivý test do mikro - centrifugační zkumavky a běží na 2000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut .
7

Extrahuje buněk s 400 mikrolitry NAD /NADH extrakčního pufru o zmrazování a rozmrazování buněk ve dvou cyklech - 20 minut na suchém ledu a 10 minut při pokojové teplotě . Vortexextrahované buňky na přesně 10 sekund.
8

Roztočte vzorky buněk v mikro - odstředivce při 14000 otáčkách za minutu po dobu přesně za 5 minut.
9

Přeneste NAD /NADH buňky do čisté zkumavky .
Testovací protokol
10

Zředěnými 10 ul standardu NADH s 990 ul NAD /NADH extrakčního pufru . Přidejte 0 , 2 , 4, 6 , 8, 10 mikrolitrů zředěného roztoku do 96-jamkové destičky v duplikátu vytváření 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 i standard. Naplňte poslední jamky se 50 mikrolitrů NAD /NADH extrakčního pufru .
11

Převod 50 ul extrahovaných vzorků buněk do 96-jamkové destičky v duplikátech jako předtím .
12

Připravte vzorky buněk pro detekci NADH . Rozkládají NAD ze vzorků buněk tím, že se 200 ul z extrahovaných vzorků buněk do Eppendorfových trubek . Zahřejte trubky do 60 stupňů Celsia po dobu přesně 30 minut do vodní lázně s řízenou teplotou . Rychlé ochlazení vzorků umístěním zkumavek na ledu . Roztočte vzorků v mikro - centrifugy pro odstranění sraženiny . Převod 50 mikrolitrů vzorků rozložit na 96-jamkové destičky v duplikátech jako předtím .
13

Smíchejte NAD kole vyrovnávací směs se 100 ul pufru NAD cyklistického směsi a 2 mikrolitry NAD cyklistického enzymu . Přidat 100 ul tohoto nového řešení do každé jamky norem NADH a vzorků .
14

Inkubujte destičku při pokojové teplotě po dobu přesně za 5 minut. Tento proces bude převést NAD na NADH .
15

Přidá se 10 ul NADH vývojáře do každé jamky . Deska se nechá sedět při pokojové teplotě po dobu minimálně 1 hodinu a maximálně 4 hodiny.
16

Přečtěte si desku a výpočet NADH .