Jak měřit NADH

NAD a NADH jsou oba pyridinu nukleotidy zapojených do metabolismu . NADH a NAD jsou co- enzymy nacházející se v mitochondriích , je hnací silou buňky . Oba NAD a NADH se účastní buněčných reakcí , jako je dýchání a fotosyntéze , kde se vytvářejí energie a vodík . Biochemické reakce NAD a NADH pohonných hmot , které vyžadují celou řadu enzymů k produkci ATP , hlavní zdroj energie v buňkách . Věci, které budete potřebovat
buňky nebo tkáně pod studie
NADH testovací sady
fosfátovým pufrem
suchý led
Topení blok
96jamkové destičce
Odstředivka
popsané trubky
čtečce destiček
Vortex
známý koncentrace NADH
Zobrazit další instrukce
testu
1

umýt buňky nebo tkáně pod studie se studenou fosfátu - pufrovaný fyziologický roztok , PBS . Extrakt buňky nebo rozpadu tkáně v extrakčním pufru umístěním směsi na suchém ledu po dobu 20 minut a potom při teplotě místnosti po dobu 10 minut . Opakujte .
2

Vortex po dobu 10 sekund . Spin v centrifuze po dobu 5 minut, aby se pelety buněk nebo tkání nečistoty . Odstraňte supernatant , kapalné fáze , a umístěte kapaliny do čisté zkumavky .
3

Filtr supernatantu přes specializované filtr k odstranění enzymů, které budou členění NADH .
4

Odebrat 200 mikro litrů , místo do čisté zkumavky a tepla na 60 stupňů Celsia v termobloku po dobu 30 minut, aby se denaturuje NAD . Ochladí se a odstředivky a odstranění kapalné fáze . Přenos 50 mikro litrů do 96 - jamkové desky ; každý vzorek by měl být dvakrát nebo třikrát . Chcete-li zjistit celkové NAD , NADt , nezahřívejte .
5

Příprava a přidat cyklistické mix na 96 - jamkové destičce . Promíchejte a inkubujte po dobu 5 minut . Přidá se 10 mikro litrů vývojář a nechat inkubovat při pokojové teplotě po dobu až 4 hodin. Přidat stop řešení . Přečtěte si změnu barvy na čtečce destiček nebo fluorimetru v závislosti na sadě .
Standardní křivka a výpočet
6

Připravte si standardní křivku tím, že známé koncentraci NADH a zředění v extrakčním pufru . Se zředí v různých koncentracích , a zajistit tak objem , zůstanestejná jako zkušební vzorky . Deska na stejném 96 - jamkové destičky jako zkušební vzorky . Přečtěte si optickou hustotu .
7

Draw standardní křivky grafu se zaměřením na ose X a optické hustoty na ose Y . Vezměte v průměru každého testovaného vzorku a přečtěte koncentrace z kalibrační křivky grafu .
8

Vypočtěte poměr NAD /NADH odečtením celkového NAD , NADt , z NADH a pak vydělením NADH .