Jak měřit životaschopnost buněk

Ve většině biologických experimentech zahrnujících buněčné kultury ,rozhodující krok zahrnuje vědět, které buňky jsou živé a které jsou mrtvá ve svém vzorku . Dye vyloučení jenejvíce populární metoda měření životaschopnosti buněk . Dye vyloučení je založen na teorii, že živé buňky obsahují intaktní membrány a mrtvé buňky nemají , čímž se mrtvé buňky absorbovat barvivo do cytoplazmy . K dispozici jsou různé barvy a protokoly a metody si vyberete by měl být založen na nákladech , citlivost , snadné a délku řízení . Trypanovou modř jebarvivo běžné používá pro měření životaschopnosti buněk , protože tento postup může být provedeno v pěti až 10 minut a stojí jen množství barviva činidla . Věci, které budete potřebovat
0,4 % trypanové modré činidla
hemacytometru
krycím sklíčkem
mikropipety
pipety tipy
fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku ( PBS )
světelným mikroskopem

Zobrazit další instrukce dovolená 1

získat peleta buněk máte měření .
2

buněčnou peletu v PBS , aby se přibližně 5 x 105 buněk /ml . PBS se používá proto, že měření životaschopnosti jsou přesnější , když jsou buňky v prostředí bez séra ; sérové ​​proteiny mohou také skvrny a dá vám k zavádějícím výsledkům .
3

Přidat stejných dílů suspenze buněk v PBS na stejných dílů 0,4 % trypanovou modří získat 1 až 2 ředění ( příklad : . 100 ul buněk na 100 ul trypanovou modří ) a promíchejte pipetováním nahoru a dolů
4

Inkubujte směs za méně než tři minuty při pokojové teplotě . Pokud buňky jsou počítány po asi pěti minutách se životaschopnost nepřesné vzhledem k buněčné smrti .
5

S krycím sklíčkem již na místě , vyplnit každou stranu pultu hemacytometru se buněčné suspenze . Typicky , bude každá strana trvat 10 až 20 ul. .
6

Umístěte hemacytometru na jevišti světelným mikroskopem a zaměřit se na buňky .
7

každé straně hemacytometru obsahuje více čtverců . Spočítejte celkový počet buněk v jednom náměstí hemacytometru . Pak spočítat neživé (modrá) a životaschopné (jasný) buňky samostatně , ve stejném náměstí .
8

Vypočítejte procento životaschopných buněk na náměstí vydělením počtu životaschopných buněk o celkovém počtu buněk a vynásobí 100. . Udělej to po dobu několika čtverců na hemacytometru získat průměrné měření životaschopnosti .