Jak test pro nukleové kyseliny

Testování pro nukleové kyseliny se provádí v lékařské diagnostice s cílem zjistit patogeny , jako jsou viry nebo bakterie . Tyto testy jsou mnohem rychlejší , a proto umožňují lékaři zahájit léčbu pro pacienta, který obvykle musela čekat na potvrzení infekce pomocí více zdlouhavé a nudné testy na bázi protilátek . Tento proces je také známý jako test amplifikace nukleových kyselin , a zahrnuje metodu známou jako " zesílení reverzní transkriptázy , " polymerázovou řetězovou reakcí . Protože se jedná o vysoce specializovaný vědecký postup , pokročilé znalosti a odborné znalosti v oblasti techniky molekulární biologie a je potřeba teorie . Věci, které budete potřebovat
PCR zkumavek
PCR cyklovač
Pipety a filtrační tipy
Rukavice
Buňky
Trizol nebo jiné RNA extrakce činidlo
PCR pufr
Taq polymerázu
RT - PCR primery v koncentraci 1 mg /ml
RNase bez vody
dNTPs
MgCl2
náhodných primerů na 1,8 mg /ml, koncentrace
SuperScript II reverzní transkriptázy

Zobrazit další instrukce
zpracování a příprava RNA
1

Sklizeň buněk s extrakčním činidlem RNA , jako je Trizol . 1 ml, je dostatečné pro sběr buněk z jedné jamky s šesti jamkami destičky pro tkáňové kultury . Buňky jsou důkladně pipetovány nahoru a dolů , aby je homogenizovat a poté provést extrakční postup , jak je popsáno v Trizol listu . Stručně , směs se extrahuje chloroformem , potom se odstředí k oddělení fází DNA , proteinů a RNA . Obnovit pouze bezbarvý RNA fázi a sraženinu , která se isopropanolu . Po inkubaci , centrifuga , že a vyčistit výsledné pelety s několika etanolu myje . Pak resuspendujte peletu v RNase - volné vodě .
2

reverzní transkripci , denaturuje přesně 5 mikrogramů RNA na 65 stupňů Celsia v 10 microliter (UL) objem RNasu volné vody , pak rychle místo na ledě . Pro každou reakci zkombinujte 10 ul RNA , 3 ul 10X PCR reakčního pufru , 2,5 ul 10 mM dNTP , 6 l 25 mM chloridu hořečnatého , 1 ul náhodných primerů 1,8 miligramu na koncentraci mililitr , a 0,5 ul Horní index II reverzní transkriptázy enzym . Doplňte každou reakci s 17 ul RNázy volné vody . Inkubujte zkumavky při pokojové teplotě po dobu deseti minut a pak při teplotě 42 stupňů Celsia po dobu jedné hodiny za vzniku cDNA , pak denaturuje při 95 stupních Celsia a rychle ledu k zastavení reakce .
3

Pro polymerázové řetězové reakce , znovu nastavit reakční směsi v 0,5 ml zkumavek spojením 6 ul cDNA bylo dosaženo v reakce reverzní transkripce , 1,5 ul 10X PCR reakčního pufru , 0,2 mikrolitrů Taq polymerázy , 0,5 mikrolitru zpětného primeru a také primeru dopředu , pak doplňte každou zkumavku s 10,3 ul RNázy volné vody . Chcete-li spustit reakce , nastavit termocykleru ( tj.stroj , který provádí polymerázová řetězová reakce ) po dobu 30 cyklů takto : 95 stupňů Celsia po dobu 0,5 minuty, aby se denaturaci , následuje 60 stupňů Celsia po dobu 45 sekund až žíhání , a konečně 72 stupňů Celsia po dobu 1 minuty prodloužení syntetizovaný přepis .