QuikChange Mutagenesis protokoly
QuikChange mutageneze jeznačka soupravy používané v biotechnologického výzkumu vyvolat genetickou mutaci nebo změnu DNA . Agilent Technologies jespolečnost za produkt , který je k dispozici ve dvou verzích , QuikChange II a QuikChange Lightning . Obě sady obsahují roztok, DNA polymerázu enzym , barevné činidla , DNA sekvence nebo primerů a vzorků buněk . Mutant Strand Syntéza Reakce protokolu
technici syntetizovat dva oligonukleotidy nebo krátké sekvence DNA obsahující požadovanou mutaci . Pak se připraví kontrolní reakce s DNA sekvencemi , dNTP mix a roztok DNA polymerázou enzymu přidáním destilované vody . Později , se připraví série vzorků reakcí za použití různých koncentrací dvouřetězcové DNA ( dsDNA ) , při zachování základní nátěr nebo koncentrace oligonukleotidů konstantní , v souladu s pokyny výrobce . Udržují vzorků na 203 stupňů F po dobu 30 sekund . Vzorek obsahující segmentu DNA číslo dvě je také testován v teplotním cyklování , techniku, kde změny teploty během krátkých časových období . Nakonec , vzorky jsou umístěny na ledu po dobu dvou minut .
Klipart DPN I Trávení protokolu produktů amplifikace
DPN I restrikční enzym snižuje DNA na určitých místech . Jeden micro - litr tohoto enzymu se přidá přímo do každé amplifikační reakce pod jeho standardní minerální oleje překrytí pomocí mikro - pipety nebo specializované aerosolu odolné špičky pipety . Nicméně , overlay olejminerální je nutné pouze v případě, že tepelný cyklovač ,zařízení použita pro amplifikaci DNA segmentů , nemá sestavu hot- top . Reakce je mírně smíšené a později dát do mikro - centrifuze po dobu jedné minuty . Za to, že se vzorky inkubují při teplotě 98,6 stupňů F po dobu jedné hodiny .
Transformace XL1 -Blue Supercompetent buněk protokol
XL1 -Blue jetetracyklin odolné buněčné linie , která přichází s výstrojí QuikChange mutageneze . V průběhu tohoto protokolu , technici rozmrazit buňky , které byly do té doby na -112 stupňů F , na ledu . Pak se přidá jeden mikro - litr DPN I- DNA ošetřené , teplo ji na 107,6 stupňů F po dobu 45 sekund a položte reakci na ledu po dobu dvou minut. Po této proceduře , technici přidejte přípravu NZY ( hydrolyzát kaseinu a výtažek z kvasnic ), předehřáté na 107,6 stupňů F a inkubujte po dobu jedné hodiny . Přípravek je pak kladen na agarových gelových deskách a inkubovány při 98,6 stupňů F po dobu 16 hodin .
