Jaké metody lze použít ke studiu interakcí protein-protein?
1. Koimunoprecipitace (Co-IP) :Co-IP je široce používaná technika pro studium interakcí protein-protein. Zahrnuje imunoprecipitaci jednoho proteinu (proteinu návnady) z buněčného lyzátu pomocí protilátky specifické pro protein návnady. Imunoprecipitovaný proteinový komplex se pak analyzuje, aby se identifikovaly další proteiny (proteiny kořisti), které interagují s proteinem návnady. Po Co-IP mohou následovat různé následné analytické metody, jako je Western blot, hmotnostní spektrometrie nebo imunofluorescenční barvení.
2. Rozbalovací testy :Pull-down testy jsou založeny na principu afinitní chromatografie. Návnadový protein je imobilizován na pevném nosiči (jako jsou magnetické kuličky nebo agarózová pryskyřice) prostřednictvím kovalentní vazby nebo fúze se značkou (např. GST nebo His-tag). Buněčný lyzát nebo purifikovaná proteinová směs se pak inkubuje s imobilizovaným návnadovým proteinem. Po promytí, aby se odstranily nenavázané proteiny, se interagující proteiny (proteiny kořisti) eluují a analyzují.
3. Přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET) :FRET je technika, která měří přenos energie mezi dvěma těsně umístěnými fluorofory (donor a akceptor). Když jsou donorové a akceptorové fluorofory v těsné blízkosti (typicky v rozmezí 10-100 Á), excitace donorového fluoroforu vede k emisi světla akceptorovým fluoroforem. Tento přenos energie lze kvantifikovat a použít ke sledování interakcí protein-protein. FRET lze implementovat různými způsoby, včetně značení proteinů specifickými fluorofory nebo použitím geneticky kódovaných fluorescenčních proteinů (např. GFP a RFP).
4. Biomolecular Interaction Analysis (BIA) :BIA, také známá jako povrchová plazmonová rezonance (SPR), je technika bez označení, která měří změny indexu lomu na rozhraní podložního sklíčka a proudící kapaliny. Jeden z interagujících proteinů je imobilizován na povrchu skla a druhý protein prochází po povrchu. Interakce mezi proteiny vede ke změnám indexu lomu, který lze detekovat a kvantifikovat. BIA může poskytnout informace o vazebné afinitě a kinetice interakcí protein-protein.
5. Izotermická titrační kalorimetrie (ITC) :ITC je technika, která měří změnu tepla spojenou s interakcí mezi dvěma molekulami. Při interakci proteinů se teplo buď uvolňuje (exotermické) nebo absorbuje (endotermické). ITC může kvantifikovat vazebnou afinitu (Kd) a termodynamické parametry, jako je změna entalpie (AH) a změna entropie (AS), interakcí protein-protein.
6. Pole interakce s proteiny :Pole pro interakce proteinů zahrnují vysoce výkonný screening interakcí protein-protein ve formátu microarray. Tisíce různých proteinů nebo peptidů jsou imobilizovány na pevném povrchu a vazba specifického proteinu, který je středem zájmu, je detekována pomocí značených protilátek nebo jiných detekčních metod. Tato technika umožňuje rychlou a rozsáhlou analýzu interakcí protein-protein.
7. Yeast Two-Hybrid (Y2H) Assay :Test Y2H je genetická metoda používaná k identifikaci interakcí protein-protein v kvasinkových buňkách. Zahrnuje fúzi kódujících sekvencí dvou proteinů se dvěma různými doménami transkripčního faktoru. Pokud tyto dva proteiny interagují, transkripční faktor se rekonstituuje, což vede k expresi reportérového genu. Pozitivní interakce jsou identifikovány na základě růstu kvasinkových buněk na selektivních médiích nebo kolorimetrických testech.
Volba metody pro studium interakcí protein-protein závisí na konkrétních požadovaných proteinech, dostupnosti činidel a vybavení a požadované úrovni informací. Kombinace těchto technik lze také použít k získání komplexního náhledu na interakce protein-protein.
